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G6P检测试剂盒(WST-8法)

简要描述:

尚宝的G6P检测试剂盒(WST-8法) (G6P Assay Kit with WST-8)是一种高灵敏度的基于WST-8的显色反应,通过比色法来检测细胞、组织或其它样品中G6P含量的检测试剂盒。

更新时间:2022-03-09型号:BA18003厂商性质:生产厂家浏览量:72

G6P检测试剂盒(WST-8法)

产品货号:BA18003

产品规格:100

产品简介:

尚宝G6P检测试剂盒(WST-8) (G6P Assay Kit with WST-8)是一种高灵敏度的基于WST-8的显色反应,通过比色法来检测细胞、组织或其它样品中G6P含量的检测试剂盒。 Ø

WST-8MTT的一种升级替代产品,和MTT或其他MTT类似产品如XTTMTS等相比有明显的优点。首先,MTT被一些脱氢酶还原生成的formazan不是水溶性的,需要有特定的溶解液来溶解;而WST-8XTTMTS产生的formazan都是水溶性的,可以省去后续的溶解步骤。其次,WST-8产生的formazanXTTMTS产生的formazan更易溶解。再次,WST-8XTTMTS更加稳定,使实验结果更加稳定。另外,WST-8MTTXTT等相比,线性范围更宽,灵敏度更高。WST-8WST-1相比,检测灵敏度更高,更易溶解,并且更加稳定。 Ø

本试剂盒使用便捷。使用细胞、组织等的裂解液即可进行检测,无需分离纯化细胞、组织或其它样品中的G6PØ 本试剂盒检测灵敏度高,线性范围宽。可以检测含量低至20μM (1nmol)G6P,在20μM (1nmol)500μM (25nmol)之间呈现良好的线性关系。 Ø

G6P (Glucose-6-phosphate,葡萄糖-6-磷酸,又称6-磷酸葡萄糖)是葡萄糖的第6位碳上的羟基在己糖激酶催化下发生磷酸化后生成的分子,是细胞中常见的糖代谢小分子,参与糖酵解(glycolytic pathway)和磷酸戊糖(pentose phosphate pathway)等生化途径。在糖酵解的第一步反应中,葡萄糖被己糖激酶催化生成葡萄糖-6-磷酸,然后通过磷酸葡萄糖异构酶的催化形成果糖-6-磷酸,以继续糖酵解的其它步骤;而在戊糖磷酸途径中,葡萄糖-6-磷酸是其第一个底物,该过程也是生成NADPH的主要途径。除了这两个代谢途径外,葡萄糖-6-磷酸也能转化形成糖原或淀粉而被存储起来。 Ø

本试剂盒可检测样品中的G6P含量,具体原理如下:葡萄糖-6-磷酸(G6P)在葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase, G6PDH)的作用下氧化生成6-磷酸葡萄糖酸内酯(6-phosphogluconate, 6-PG)在这一反应中NADP+ 被还NADPH,生成的NADPH在电子耦合试1-mPMS (1-Methoxy-5-methylphenazinium Methyl Sulfate)的作用下将WST-8还生成橙黄色的formazan,在450nm左右有最大吸收峰。反应体系中生成的formazan与样品中总的G6P的量呈正比关系。 WST-8法检测G6P的原理参考图1

本试剂盒适用于检测细胞、组织以及其它适当样品中G6P的含量。 Ø

本试剂盒可以测定100个样品。

产品组成:

产品名称

100

酶混合液

220μl

G6P标准品(10mM)

100μl

显色液

220μl

反应缓冲液

5.5ml

G6P提取液

50ml

使用说明:

1. 样品的准备:

a. G6P提取液室温或37ºC水浴解冻,解冻后置于冰浴。如果37℃水浴解冻,须注意解冻后立即置于冰浴。

b. 细胞样品的准备:对于贴壁细胞,约1×106个细胞(大约相当于6孔板一个孔长满的细胞数量),吸净培养液,用移液器加入200μl的冰浴预冷的G6P提取液,并轻轻吹打,以促进细胞的裂解;对于悬浮细胞,收集约1×106个细胞,600g离心5分钟,吸净培养液,用移液器加入200μl冰浴预冷的G6P提取液,并轻轻吹打,以促进细胞的裂解。裂解过程宜尽量在冰上操作。随后12,000g4℃离心5-10分钟,取上清作为待测样品,冰浴存放备用。

c. 组织样品的准备:冰浴预冷的PBS洗涤组织后,称取约10-50mg的组织样品,用剪刀剪碎,置于匀浆器中,加入400μl的冰浴预冷的G6P提取液在冰上或室温进行匀浆。随后12,000g4ºC离心5-10分钟,取上清作为待测样品,冰浴存放备用。注:匀浆过程在冰上或室温操作均可,但以冰浴操作为佳,可以有效减少内源性G6P水平的下降。

d. 液体样品可以直接进行检测。

注意:如果样品中存在能转变或消耗G6P的酶,在检测前需使用10kDa超滤管去掉蛋白质以避免酶的影响。

2. 试剂盒的准备工作:

a. G6P标准溶液的制备:把10mMG6P标准品用G6P提取液稀释成适当的浓度梯度。如初次检测可以设置031.2562.5125250500μM这几个浓度,检测时96孔板每孔加入50μl的标准品,相当于每孔加入的G6P的量为01.563.1256.2512.525nmol。如有必要,在后续的实验中可以根据样品中的G6P含量对标准品的浓度范围进行适当调整。其中浓度为0μM的点为空白对照点(Blank),仅含G6P提取液。

b. G6P检测液的配制:样品中的NADPH等可能会产生一定的背景,建议设置加入样品而不加入酶混合液的背景对照;对于标准品和样品的G6P检测液,需要加入酶混合液。每个背景对照、标准品或样品的检测需要使用50μlG6P检测液,请根据所需检测的背景对照、标准品和样品的数量,配制适量的G6P检测液,并注意现配现用。G6P检测液的配制方法如下:


G6P检测液(背景对照)

G6P检测液(标准品或样品)

反应缓冲液

48μl

46μl

显色液

2μl

2μl

酶混合液

-

2μl

3. 样品测定:

a. 样品中G6P含量的测定:吸取50μl待测样品至96孔板中,为了减少实验建议设置样品的重复孔。后续如果发现样品中的G6P含量过高,超出标准品的标准曲线的范围,则需要用G6P提取液将样品适当稀释后再进行检测;含量过低时则需要 加大细胞或组织样品的用量。

b. 每孔加入50μl G6P检测液,用移液枪轻轻吹打均匀。在加入G6P检测液的过程中须轻柔操作,以免产生气泡。若不慎出现气泡,可使用细小的吸头或针头戳破。背景对照孔需要加入50μl不含G6P底物的G6P检测工作液。特别注意:如果样品中的NADPH等产生的背景比较高,就必须设置背景对照;初次检测宜设置背景对照。

c. 37℃避光孵育10分钟,此时会形成橙黄色的formazan。测量450nm处的吸光度,如果显色较浅,也可以适当延长孵育时间至15-30分钟,随着孵育时间的延长显色会越来越深。

4. 样品中G6P含量的计算:

a. 将标准品和样品的吸光度减去标准品浓度为0μM的空白对照(Blank)吸光度。同时,如果背景对照(Background)的吸光度比较高,需要再将所有样品的吸光度减去各自的背景对照的吸光度。

b. G6P浓度为横坐标,吸光度为纵坐标,绘制出标准曲线。G6P标准品的检测效果请参考图2

2. 本试剂盒检测G6P的标准曲线。图中的反应时间为30分钟。不同的检测条件下,实际读数会因标准品的配制、检测仪器等的不同而存在差异,图中数据仅供参考。

c. 根据标准曲线计算细胞、组织等样品中的G6P浓度。

备注:根据检测得到的浓度及样品的体积,即可计算出G6P的量。

d. 如果希望更加精确地来表述G6P的量,可以将样品用BCA法测定蛋白浓度。最终用单位蛋白量中G6P的量来比较精确地进行表述。

注意事项

1. 经检测本试剂盒中的酶混合液室温存放72小时或反复冻融5次不影响其酶活性。 Ø

2. 由于G6P提取液略显粘稠,以该提取液作为稀释液时,无论对标准品还是样品进行稀释,在稀释过程中务必确保稀释均匀,否则易造成实验数据产生较大波动。 Ø

3. 在样品加样和混匀过程中,须尽量避免产生气泡,以免影响最终的吸光度测定。 Ø

4. 如果不能非常严格地控制反应温度和反应时间,每次检测都需要设置标准曲线。 Ø

5. 如果样品溶液中G6P浓度过高或过低,不在试剂盒的线性检测范围内时,可适当调整样品或者提取液的用量。 Ø

6. 尽量使用新鲜样品进行检测,冻存或反复冻融的细胞或组织样品可能对结果有一定影响。 Ø

7. 本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品,不得存放于普通住宅内

8. 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作

保存条件-20ºC保存,一年有效。显色液须-20ºC避光保存



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