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石蜡包埋组织蛋白提取试剂盒

简要描述:

石蜡包埋组织蛋白提取试剂盒
从固定在福尔马林中提取和纯化出来的蛋白,可用于western blot,RPA,质谱,2D电泳分析。

更新时间:2022-02-24型号:BA1793厂商性质:生产厂家浏览量:57

石蜡包埋组织蛋白提取试剂盒

产品货号:BA1793

 

产品规格:50T

 

产品简介:

从固定在福尔马林中提取和纯化出来的蛋白,可用于western blotRPA,质谱,2D电泳分析。

 

产品组成: 

试剂名称

50T

保存条件

蛋白提取缓冲液EXB

5ml

-20℃

二甲苯

5ml

室温

正庚烷

5ml

室温

β-巯基乙醇

300μl

室温

甲醇

30ml

室温

氯仿

5ml

室温

试剂盒成分保存

提取缓冲液EXB应存放在-20°CFFPE试剂盒中其它的组分应存放在室温干燥环境(15-25°C)FFPE中的其它成分正庚烷,甲醇,氯仿应储存在适当的储藏柜中,此条件下,该试剂盒至少可以稳定保存12个月。

 

载玻片上的石蜡组织切片脱蜡:

用户须自备的设备和试剂:

100%96%,和70%(V/V)乙醇

石蜡包埋切片脱蜡罐

 

实验开始前注意事项:

二甲苯清洗(步骤12)应在通风橱内进行。

 

实验步骤

1. 将载玻片转移到一个合适的装有二甲苯的容器中,玻片要被二甲苯完全覆盖,室温(15-25°)孵育10min

2. 重复步骤1两次,每次使用新的二甲苯。

3. 将玻片放入100%乙醇中室温孵育10min,使用新的100%乙醇重复此步。

4. 将玻片转移到一个含有96%的乙醇的容器中孵育10min,使用新的96%乙醇重复这一步骤。

5. 将玻片转移到一个含有70%的乙醇的容器中孵育10min,使用新的70%乙醇重复这一步骤。

6. 浸在双蒸馏水中30s,用纸巾小心地擦去玻片上的水。

注意:纸巾不要触碰到组织,确保组织不要干。

7. 用针划要的组织转移到离心管中。

8. FFPE组织切片中提取的总蛋白可进行western blot

 

直接从一块石蜡包理样本中脱蜡:

用户须自备的设备和试剂:

微型离心机(适合于1.5ml离心管)

涡旋混合器

100%96%and70%(vv)乙醇

实验开始前注意事项:

所有离心步骤都是在20-25°C使用台式进行离心(例如,Eppendorf® Micro Centrifuge 5417C or HeraeusBiofuge® 15 )

二甲苯洗涤应在通风橱内进行。

 

实验步骤:

1. 从同一块组织中切310-15m厚切片。

2. 立即把切片放在1.5毫升离心管中(提供)

3. 向管子中加入1ml二甲苯,用力涡旋10s,孵育10min

4. 将管子放入微型离心机中全速离心2min,小心弃掉上清。

5. 重复步骤34两次。

6. 加入1ml无水乙醇到包含有颗粒的管子中,涡旋混匀。孵育10min,全速离心2min

7. 小心弃掉上清。

8. 不要搅乱管底颗粒

9. 重复步骤6

10. 1mL96%乙醇到管中,涡旋混匀。孵育10分钟,全速离心2min

11. 小心弃掉上清。

12. 不要搅乱管底颗粒。

13. 重复步骤1112

14. 1mL70%乙醇到管中,涡旋混匀。孵育10分钟,全速离心2min

15. 小心弃掉上清。

16. 不要搅乱管底颗粒。

17. 重复步骤1415

注意:如有必要,重复离心的步骤,尽量去除乙醇残留。不要搅乱和弃掉管底颗粒。

18. FFPE组织切片中提取的总蛋白可进行进行westem blot

 

从石蜡组织切片中提取的总蛋白用于western blot实验:

用户须自备的设备和试剂:

一次性手套

台式离心机或微型离心机(转速能达到14000xg

涡旋混匀器

水浴或者金属浴锅(温度能够达到100℃

热电搅拌器(Eppendorf,德国)

实验开始前注意事项

使用β-巯基乙醇应在通风橱中操作

实验开始前注意事项:

提供的提取缓冲液EXB未加β-巯基乙醇,每次提取过程中添加6μLβ-巯基乙醇到提取94μL的提取缓冲液EXB获得工作液。

 

蛋白提取:

1. 100μL提取缓冲液EXB(已加入β-巯基乙醇)加入到装有组织的1.5ml的离心管中,涡旋混匀,用密封夹封号离心管。

2. 冰上孵育5min,涡旋混匀。

注意:确定离心管已经被密封好后在进行步骤3

3. 将离心管放在水溶锅中100°C孵育20min

4. 使用热电搅拌器,以750rpm速度,80℃,搅拌2h

5. 然后将离心管放在4℃1min,去掉密封夹。

6. 将离心管置于离心机中,4℃14000xg,离心15min

7. 转移含所提蛋白质的上清液到一个新的1.5毫升的离心管中(提供)

 

FFPE组织中提取蛋白用于双向电或MS分析:

实验开始前注意事项:

提供的提取缓冲液EXB未加β-巯基乙醇。每次提取过程中添加6μLβ-巯基乙醇到提取94μL的提取缓冲液EXB获得工作液。

 

流程:

脱蜡:

1. 从同一块组织中切310-15μm厚切片。

注意:如果你不确定你的样品中含有多少蛋白质,我们建议使用2个切片,每一个厚度为10um,面积100平方毫米制备。

2. 把切片在1.5毫升离心管中(提供)

3. 吸取0.5mL的庚烷到管子中,盖紧管子用力涡旋10s,室温孵育1h(15-25℃)

4. 25μL甲醇,扣紧管子,大力涡旋10s

5. 9000xg离心2分钟。

管底会出现沉淀

6. 小心弃掉上清,在空气中干燥5min

蛋白提取

7. 100μL提取缓冲液EXB(已加入β-巯基乙醇)加入到装有组织的1.5mL的离心管中,涡旋混匀,用密封夹封号离心管。

8. 冰浴5min,然后涡旋混匀。

确保离心管密封好再进行步骤9

9. 将离心管在100℃水浴锅中孵育20min

10. 使用热电搅拌器,以750rpm速度,80℃,搅拌2h

11. 然后将离心管放在4℃1min,去掉密封夹。

在进行12步之前确定密封夹已经被去除。

12. 将离心管置于离心机中,4℃14000xg,离心15min。转移含所提蛋白质的上清液到一个新的1.5mL的离心管中(提供)

 

双向电泳蛋白样品制备:

13. 400μL甲醇到100μL步骤12所得的蛋白溶液中,扣紧盖子,大力涡旋10s

14. 9000xg离心10s

15. 100μL氯仿,扣紧管子,大力涡旋10s

16. 9000xg离心10s

17. 300μL水,扣紧管子,用力涡旋10s

18. 9000xg离心1min

注意:离心后,样品分为3层:最层,无色,有机相(氯仿);中间层含蛋白质;上部,无色,水相。

19. 小心弃掉上层水相。

不要搅乱中间层和底层。

20. 300μL甲醇,扣紧盖子,大力涡旋。

21. 9000xg离心2min

22. 小心弃掉上清。

注意:该蛋白是位于管子底部的可见的透明或白色凝胶状沉淀。

23. 加入1mL乙醇到离心管中洗涤沉淀,而后9000xg离心2min,小心弃掉上清。

注意:不要使沉淀干燥

24. 加入适量体积的缓冲液溶解蛋白沉淀用于双向电泳。

根据凝胶尺寸和染色方法,双向电泳分析所需的蛋白质量从50-250μg


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