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乙醇酸氧化酶活性检测试剂盒(微量法)

简要描述:

乙醇酸氧化酶活性检测试剂盒(微量法)
乙醇酸氧化酶(EC1.1.3.15)是乙醇酸循环中的一种酶,也是植物光呼吸代谢中的关键酶,催化乙醇酸氧化生 成乙醛酸,通过测定乙醇酸氧化酶活性,可以了解植物光合和呼吸代谢的基本方法。 乙醇酸氧化酶催化乙醇酸氧化生成乙醛酸,乙醛酸和盐酸苯肼反应生成乙醛酸苯腙,在324nm有特征吸收峰。

更新时间:2021-11-19型号:BA1436-100厂商性质:生产厂家浏览量:14

乙醇酸氧化酶活性检测试剂盒(微量法)

产品货号:BA1436

 

产品规格:100/96

 

产品简介:

乙醇酸氧化酶(EC1.1.3.15)是乙醇酸循环中的一种酶,也是植物光呼吸代谢中的关键酶,催化乙醇酸氧化生 成乙醛酸,通过测定乙醇酸氧化酶活性,可以了解植物光合和呼吸代谢的基本方法。 乙醇酸氧化酶催化乙醇酸氧化生成乙醛酸,乙醛酸和盐酸苯肼反应生成乙醛酸苯腙,在324nm有特征吸收峰。 注意:实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者 增加样本量进行检测。

 

产品组成:

产品名称

规格

储存条件

提取液

液体60mL×2

4℃

试剂一

液体15mL×1

4℃

试剂二

粉剂×2

-20℃

试剂三

液体2mL×1

4℃

溶液的配制:

1.        试剂二:临用前加入2.5mL双蒸水溶解,用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。

 

需自备的仪器和用品:

紫外分光光度计/酶标仪、低温离心机、可调式移液枪、微量石英比色皿/96孔板UV板、天平、研钵/匀浆器、 冰和蒸馏水。

 

操作步骤:

一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)

组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为15~10的比例(建议称取约0.1g 组织,加入1mL提取液)进行冰浴匀浆,然后10000g4℃,离心10min,取上清置冰上待测。

细胞或细菌:按照细胞数量(104个):提取液体积(mL)为500~10001的比例(建议500万细胞加入1mL 提取液),冰浴超声波破碎细胞(功率300w,超声3秒,间隔7秒,总时间3min);然后10000g4℃,离心10min,取上清置于冰上待测。

二、测定步骤

1.        紫外分光光度计/酶标仪预热30min以上,调节波长至324nm,紫外分光光度计蒸馏水调零。

2.        将试剂一25℃预热15min

3.        样本测定:在微量石英比色皿/96UV板中分别加入下列试剂:

试剂名称

测定管

空白管

试剂一(μL

130

130

蒸馏水(μL

-

10

样本(μL

10

-

试剂二(μL

40

40

试剂三(μL

20

20

充分混匀,立即测定324nm10s190s吸光值A1A2,计算ΔA测定管=A2测定-A1测定,ΔA空白管=A2空白-A1空白,ΔA=ΔA测定管-ΔA空白管。(空白管只需做1-2次)

 

GO酶活计算

1.  按微量石英比色皿计算:

(1)按蛋白浓度计算

酶活定义:每毫克蛋白每分钟生成1nmol乙醛酸苯肼所需的酶量为一个酶活力单位。

GO酶活(U/mg prot=ΔA÷ε×d×V反总×109÷V×Cpr÷T=392.16×ΔA÷Cpr

(2)按样本质量计算

酶活定义:每克组织每分钟生成1nmol乙醛酸苯肼所需的酶量为一个酶活力单位。

GO 酶活(U/g 质量)=ΔA÷ε×d×V反总×109÷V×W÷V样总)÷T=392.16×ΔA÷W

(3)按细胞数量计算

酶活定义:每万细胞每分钟生成1nmol乙醛酸苯肼所需的酶量为一个酶活力单位。

GO酶活(U/104 cell=ΔA÷ε×d×V反总×109÷V×500÷V样总)÷T=0.784×ΔA

ε:乙醛酸苯腙毫摩尔消光系数:17000L/mol/cmd:比色皿光径,1cmV反总:反应总体积,2×10-4LV样:反应中样本体积,0.01mLV样总:加入提取液体积,1mLCpr:样本蛋白浓度,mg/mL,蛋白浓度自行测定;W:样本质量,gT:反应时间,3min500500万个细胞;109:单位换算系数,1mol=109nmol

2.  96UV板计算:

将上述公式中的d-1cm改为d-0.6cm96UV板光径)进行计算即可。

 

注意事项:

1.        测定之前进行预实验,若吸光值A1>1,请将样本用提取液进行适当的稀释再测定,并在计算公式中乘以稀释倍数。

2.        色素含量较高的样本,可在提取酶时加活性炭吸附。

3.        空白管为检测各试剂组分质量的检测孔,正常情况下,其OD值变化不超过0.02

 

实验实例:

1.        称取约0.1g三叶草组织,加入1mL提取液,进行冰浴匀浆,然后10000g4℃,离心10min,取上清进行检测,使用微量石英比色皿测得ΔA测定管=A2测定-A1测定=0.8956-0.7839=0.1117ΔA空白管=A2空白-A1空白=0.0853-0.077=0.0083ΔA=ΔA测定管-ΔA空白管=0.1117-0.0083=0.1034,按样本质量计算酶活得:GO酶活(U/g 质量)=392.16×ΔA÷W=405.4934 U/g 质量。

2.        称取约0.1g菠菜组织,加入1mL提取液,进行冰浴匀浆,然后10000g4℃,离心10min,取上清稀释2倍进行检测,使用微量石英比色皿测得ΔA测定管=A2测定-A1测定=0.9286-0.8105=0.1181ΔA空白管=A2空白-A1空白=0.0853-0.077=0.0083ΔA=ΔA测定管-ΔA空白管=0.1181-0.0083=0.1098,按样本质量计算酶活得:GO酶活(U/g质量)=392.16×ΔA÷W×2(稀释倍数)=861.1834 U/g质量。

 


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