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质粒大量提取试剂盒

简要描述:

质粒大量提取试剂盒采用碱裂解法裂解细胞,根据离心吸附柱在高盐状态下特异性地结合溶液中的DNA的原理特异性提取质粒DNA。离心吸附柱中采用的硅基质材料能高效、专一地吸附DNA,可最大限度去除杂质蛋白及细胞中其他有机化合物,一般从50-100ml大肠杆菌LB培养液中,可快速提取200-300μg高纯度高拷贝的质粒DNA,提取率达85-90%。

更新时间:2021-08-26型号:厂商性质:生产厂家浏览量:74

质粒大量提取试剂盒 


产品货号:26243 

产品规格:10T 

产品简介:本试剂盒采用碱裂解法裂解细胞,根据离心吸附柱在高盐状态下特异性地结合溶液中的DNA的原理特异性提取质粒DNA。离心吸附柱中采用的硅基质材料能高效、专一地吸附DNA,可最大限度去除杂质蛋白及细胞中其他有机化合物,一般从50-100ml大肠杆菌LB培养液中,可快速提取200-300μg高纯度高拷贝的质粒DNA,提取率达85-90%。 使用本试剂盒提取的质粒DNA可适用于各种常规操作,包括酶切、PCR、测序、 连接和转化等试验。使用前请先在漂洗液中加入无水乙醇,加入体积请参照瓶体上的标签。溶液Ⅰ在使用前先加入RNaseA(将试剂盒中提供的RNaseA全部加入),混匀,置于2-8℃保存。如非指明,所有离心步骤均为使用台式离心机在室温下离心。产品组成:试剂名称 10TRNaseA ( 10mg/ml ) 1ml溶液Ⅰ 60ml溶液Ⅱ 60ml溶液Ⅲ 80ml漂洗液 2×15ml洗脱液 30ml吸附柱 10 个收集管(50ml) 10 个

 操作步骤: 

  1. 收集 50-100ml 过夜培养的菌液 11000rpm 离心 10 分钟,尽量吸除上清(菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中)。

    2. 向留有菌体沉淀的离心管中加入 5ml 溶液Ⅰ (请先检查是否已加入 RNaseA) ,使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀。注意:如果菌块未彻底混匀,会影响裂解导致质粒提取量和纯度偏低。

  2. 3. 向离心管中加入 5ml 溶液Ⅱ,温和地上下翻转 6-8 次使菌体充分裂解。

    注意:

    ①翻转一定要温和,以免污染细菌基因组 DNA。

    ②作用时间不要超过 5 分钟,以免质粒受到破坏。

    4. 向离心管中加入 7ml 溶液Ⅲ ,立即温和地上下翻转 6-8 次,充分混匀,此时会出现白色絮状沉淀(如菌液过多,可在此步放置 5 分钟,以尽可能的降解 RNA)。11000rpm 离心 10 分钟,用移液器小心地将上清转移到另一个干净的离心管中,注意尽量不要吸出沉淀。

    注意:溶液Ⅲ加入后应立即混匀,避免产生局部沉淀。 如果上清中还有微小白色沉淀,可再次离心后取上清。

    5. 将上一步所得上清液加入吸附柱中(吸附柱放入收集管中),室温放置 2-3 分钟,11000rpm 离心 30-60 秒,倒掉收集管中的废液,将吸附柱重新放回收集管中(如为提高得率,可将收集管中的液体加入吸附柱再次吸附一次)。6. 向吸附柱中加入 8ml 漂洗液(使用前请先检查是否已加入无水乙醇),11000rpm 离心 2min,弃废液,将吸附柱放入收集管中。

    7. 向吸附柱中加入 6ml 漂洗液,11000rpm 离心 2min,弃废液,将吸附柱放入收集管中。8. 11000rpm 离心 5min,将吸附柱敞口置于室温或 50℃温箱放置数分钟,目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除,否则漂洗液中的乙醇会影晌后续的实验如酶切、PCR 等。

    9. 将吸附柱放入一个干净的离心管中,向吸附膜中央悬空滴加 1-2ml 经 65℃水浴预热的洗脱液,室温放置 5min,11000rpm 离心 2min,收集质粒溶液用于后续实验。

    10. 为了增加质粒的回收效率,可将得到的洗脱液重新加入吸附柱中,室温放置 5min,11000rpm 离心 2min。

    注意事项:

    1. 使用前请先检查溶液Ⅱ和溶液Ⅲ是否出现混浊,如有混浊现象,可在 37℃水浴中加热几分钟,待溶液恢复澄清后再使用。溶液Ⅱ、溶液Ⅲ和漂洗液使用后应立即拧紧盖子。

    2. 洗脱缓冲液体积不应少于 500ul,体积过小影响回收效率;洗脱液的 pH 值对洗脱效率也有影晌,若需要用水做洗脱液应保证其 pH 值在 8.0 左右(可用 NaOH 将水的 pH 值调至此范围), pH 值低于 7. 0 会降低洗脱效率。 DNA 产物应保存在-20℃,以防 DNA 降解。

    3. 如果所提质粒为低拷贝质粒或大于 10kb 的大质粒,应加大菌体使用量,使用 400-800ml 过夜培养物,同时按照比例增加溶液Ⅰ、溶液Ⅱ和溶液Ⅲ的用量,吸附和洗脱时可以适当的延长时间,以增加提取效率。

    4. DNA 浓度及纯度检测:得到的质粒 DNA 纯度与样品保存时间、操作过程中的剪切力等因素有关。得到的DNA 可用琼脂糖疑胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。DNA 应在 OD260 处有显著吸收峰,OD260 值为 1 相当于大约 50μg/ml 双链 DNA、 40μg/ml 单链 DNA。OD260/OD280 比值应为 1.7-1.9,如果洗脱时不使用洗脱缓冲液,而使用去离子水,比值会偏低,因为 pH 值和离子存在会影响吸光值,但并不表示纯度低。

    保存条件:常温保存,复检期一年。



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