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His标签蛋白纯化试剂盒(可溶性蛋白)

简要描述:

His标签蛋白纯化试剂盒(可溶性蛋白)包含Ni-Agarose填料、亲和柱空柱以及可溶性His融合蛋白纯化所需的全部试剂(细菌裂解液、蛋白酶抑制剂混合物、结合缓冲液和洗脱缓冲液组分),使用方便。该镍柱纯化系统对6�His-tag蛋白具有显著特异吸附能力,能够高效一步纯化带有6个组氨酸亲和标签的蛋白。

更新时间:2021-08-03型号:厂商性质:生产厂家浏览量:56

His-Tagged Protein Purification Kit (Soluble Protein)

His标签蛋白纯化试剂盒(可溶性蛋白)

产品货号:264215ml

 

产品简介

His标签蛋白纯化试剂盒(可溶性蛋白)包含Ni-Agarose填料、亲和柱空柱以及可溶性His融合蛋白纯化所需的全部试剂(细菌裂解液、蛋白酶抑制剂混合物、结合缓冲液和洗脱缓冲液组分),使用方便。该镍柱纯化系统对6×His-tag蛋白具有显著特异吸附能力,能够高效一步纯化带有6个组氨酸亲和标签的蛋白。该系统具有4Ni2+螯合位点,较只有3个螯合位点的Ni-IDA结合Ni2+ 更为牢固,有效防止纯化过程中Ni2+脱落且增强对His标签蛋白的结合能力,提高纯化效率。较高的基团密度,大大提高了蛋白载量。该系统在天然或变性条件下,对来源于各种表达系统(如杆状病毒,哺乳细胞,酵母以及细菌)中的His标签蛋白,均有很好的纯化效果。本产品已螯合镍离子,可直接用可溶性蛋白的纯化,使用方便,快捷。

支持物: CL-6B琼脂糖凝胶

载量: 20-30 mg His标签蛋白/ml填料

粒径: 50-160 µm

 

产品内容:

产品名称

包装

储存条件

Ni-Agarose Resin

5 ml

2-8℃,避免冷冻

Bacterial Protein Extraction Reagent

65 ml

室温

1 M Tris-HClpH7.9

15 ml

室温

1 M Imidazole

65 ml

室温

3 M NaCl

120 ml

室温

Protease Inhibitor Cocktail

700 µl

-20℃

Affinity Column (12 ml)

1 set

室温

 

操作步骤:

缓冲液的准备    

可溶性蛋白纯化缓冲液配方:

Component

Tris-HClpH7.9

Imidazole

NaCl

Soluble Binding Buffer

20mM

10mM

0.5 M

Soluble Elution Buffer

20mM

500mM

0.5 M

组装层析柱

1. Ni-Agarose Resin填料混匀后加入层析柱,室温静置10分钟,待凝胶与溶液分层后, 把底部的出液口打开,让乙醇通过重力作用缓慢流出。

注意:

1)填料的上层是乙醇保护层,将填料和乙醇一起混匀,以每ml填料纯化20-30mg His标签蛋 白计算,取需要的填料与乙醇的混合液加入层析柱。

2)如果乙醇不流出,可以给柱子一个外力,例如用大拇指对柱口轻轻按压一下,迫使乙醇流出。

3)本实验都是通过重力作用使溶液流出。

2. 向装填好的柱中加入5倍柱体积的去离子水将乙醇冲洗干净后,再用10倍柱体积的 Binding Buffer平衡柱子,平衡结束后即可上样。

注意:柱体积指的是填料的体积。

可溶性蛋白的纯化

1. 收集菌体后,每100 mg菌体(湿重)加入1-5 ml细菌裂解液(每1 ml 细菌抽提试剂中已加入10 μl 白酶抑制剂混合物),超声裂解菌体。

注意:

1)当提取物粘度高或提取蛋白为包涵体时,建议加入DNase ILysozyme。每1 ml 细菌抽提试剂中加入1 μl DNase I1,000 U/ml),2 μl Lysozyme50 mg/ml

2)超声过程中保持菌液处于冰浴中,超声条件依赖于所使用的超声仪功率,探头种类,容器的大小形状,需实验中自己摸索,应避免连续超声导致的大量产热,可分成短时间,多次超声,通过一定的间隔时间避免溶液过热。最终菌液变清即可。

2. 10000 rpm,4℃离心3分钟,收集上清中的可溶性蛋白。

3. Binding Buffer将菌体裂解液等倍稀释后负载上柱,流速为10倍柱体积/小时,收集流穿液。

注意:

1)本试剂盒中附带有一块筛板,使用时先将筛板加至填料的上层,该筛板可用于杂质较多的蛋白的过滤,防止过多的杂蛋白堵塞柱子的作用。再将处理好的样品负载上柱,但是筛板放入柱子后就不易取出。

2)通过控制加入的菌体裂解液的速度来控制流速。

4. 使用15倍柱体积的Soluble Binding Buffer冲洗柱子,洗去杂蛋白。

5. 使用适量Soluble Elution Buffer洗脱,收集洗脱峰。

   注意:洗脱峰可以分管收集,每1 ml收集1管,并采用蛋白监测仪监测,收集洗脱峰

6. 洗脱后,依次使用10倍柱体积的去离子水洗涤柱子,再用3倍柱体积的20%乙醇平衡(乙醇要将填料浸没),封柱后2-8℃保存。

   注意:如果是分段梯度洗脱,最大洗脱缓冲液中咪唑浓度未达到500 mM时,则使用浓度为500 mM的咪唑进行洗脱10倍柱体积后,再进行第6步的操作

柱再生

当填料使用多次后,结合效率会有所下降(表现为流速变慢或填料失去蓝绿色), 可以用以下方法再生,提高填料的使用寿命和蛋白质的结合效率。

1.  使用2倍柱体积的6 M盐酸胍冲洗后,使用3倍柱体积的去离子水冲洗。

2.  使用1倍柱体积的2% SDS冲洗。

3.  依次使用1倍柱体积的25%50%75%5倍柱体积的100%乙醇冲洗,再依次使用1倍柱体积的75%

50%25%的乙醇冲洗。

4.  使用1倍柱体积的去离子水冲洗。

5.  使用5倍柱体积含50 mM EDTA缓冲液(PH8.0)冲洗。

6.  使用3倍柱体积去离子水,3倍柱体积20%乙醇冲洗。

7.  2-8°C保存。

8.  再次使用前,需首先使用10倍柱体积去离子水冲洗,然后使用5个柱体积的50 mM NiSO4再生,3个柱体积的Binding Buffer平衡。

 

注意事项:

1.  在纯化之前采用电泳检测蛋白的可溶性,本试剂盒只适合于可溶性蛋白的纯化。

2.  缓冲液中不建议使用β-巯基乙醇、DTTEDTA

3.  整个纯化过程中切忌凝胶脱水变干。

4.  为提高纯化效率,首先确定Binding BufferElution Buffer中咪唑的最佳使用浓度。必要时可以使用线性或梯度浓度的咪唑浓度,Binding Buffer的范围为0-10 mM,洗脱缓冲液的范围为10-500 mM来进行。并通过SDS-PAGEWestern Blotting来检测目的蛋白的纯度。

5.  请使用高纯度的试剂配制缓冲液,并通过0.22µm或者0.45µm过滤器过滤。为避免柱子被堵塞,建议将裂解液进行离心,或者使用0.22µm或者0.45µm过滤器过滤。

6.  柱再生时,保证每步洗完后都要用足够的去离子水冲洗至中性。

 

 


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