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3-磷酸甘油醛脱氢酶活性检测试剂盒

简要描述:

3-磷酸甘油醛脱氢酶活性检测试剂盒测定意义:
GAPDH催化3-磷酸甘油醛氧化生成1,3-二磷酸甘油酸,是糖酵解途径的关键酶,与糖异生途径、体内血糖浓度的维持和糖尿病的发生密切相关,在机体糖、脂、蛋白代谢紊乱疾病中发挥重要作用。

更新时间:2021-01-15型号:厂商性质:生产厂家浏览量:80

3-磷酸甘油醛脱氢酶活性检测试剂盒

(微量法)

正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定。

产品货号:BA1002

产品规格:100管/96样

3-磷酸甘油醛脱氢酶活性试剂盒测定意义:

      GAPDH催化3-磷酸甘油醛氧化生成1,3-二磷酸甘油酸,是糖酵解途径的关键酶,与糖异生途径、体内血糖浓 度的维持和糖尿病的发生密切相关,在机体糖、脂、蛋白代谢紊乱疾病中发挥重要作用。

测定原理:

3-磷酸甘油醛脱氢酶活性试剂盒活性检测试剂盒催化三磷酸甘油酸和ATP生成1,3二磷酸甘油酸。GAPDH逆向催化1,3二磷酸甘油酸和 NADH生成3磷酸甘油醛、无机磷和NAD,340nm处测定NADH的减少量可反映GADPH活性的高低。

需自备的仪器和用品:

分光光度计/酶标仪、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏 水。

试剂的组成和配制:

                             提取液:100mL×1 瓶,4℃保存;

                             试剂一:粉剂×1 瓶,-20℃保存;

                             试剂二:液体20mL×1 瓶,4℃保存;

                             试剂三:液体×1 支,4℃保存。

样本的前处理:

1、细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(10 4 个):提取液体 积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细菌或细胞加入1mL提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功 率 20%或200W,超声3s,间隔10s,重复30次);8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。

2、组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL提取液), 进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。

测定步骤:

1、分光光度计或酶标仪预热30min以上,调节波长至340nm,蒸馏水调零。

2、样本测定

(1)工作液的配制:将试剂二全部倒入试剂一瓶中,充分溶解,37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)预热10分钟; 现配现用。

(2)在试剂三中加入500μL蒸馏水,充分混匀待用;用不完的试剂4℃保存一周。

(3)在微量石英比色皿或96孔板中加入5μL 样本、5μL试剂三和190μL工作液,混匀,加入后一个试剂的同 时开始计时,记录340nm处20s时的吸光值A1和5min20s后的吸光值A2,计算 ΔA=A1-A2。

GAPDH 活性计算:

a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下

(1)按样本蛋白浓度计算: 单位的定义:每mg组织蛋白每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

GAPDH(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×10 9]÷(V样×Cpr) ÷T

                                                  =1286×ΔA÷Cpr

(2)按样本鲜重计算 单位的定义:每g组织每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

GAPDH(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×10 9]÷(W×V样÷V样总) ÷T

                                              =1286×ΔA÷W 

(3)按细菌或细胞密度计算 单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

GAPDH(nmol/min/104cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×10 9]÷(500×V样÷V样总) ÷T

                                                =2.57×ΔA 

V反总:反应体系总体积,2×10 -4 L;ε:NADH摩尔消光系数,6.22×10 3 L/mol/cm;d:比色皿光径,1cm; V样:加入样本体积,0.005 mL;

V样总:加入提取液体积,1mL;T:反应时间,5 min;Cpr:样本蛋白质浓度, mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500万

b.用96孔板测定的计算公式如下

(1)按样本蛋白浓度计算

单位的定义:每mg组织蛋白每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

GAPDH(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×10 9]÷(V样×Cpr) ÷T

                                                 =2572×ΔA÷Cpr

(2)按样本鲜重计算

单位的定义:每g组织每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

GAPDH(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×10 9]÷(W ×V样÷V样总) ÷T

                                              =2572×ΔA÷W

(3)按细菌或细胞密度计算

单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

GAPDH(nmol/min/10 4cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×10 9]÷(500×V样÷V样总) ÷T

                                                 =5.144×ΔA

V反总:反应体系总体积,2×10 -4 L;ε:NADH 摩尔消光系数,6.22×10 3 L/mol/cm;d:96孔板光径,0.5cm; V样:加入样本体积,0.005 mL;V样总:加入提取液体积,1mL;T:反应时间,5 min;Cpr:样本蛋白质浓度, mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500万。

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