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红细胞裂解液(蛋白类)

简要描述:

红细胞裂解液(蛋白类)多种成分均可以从细胞中提取总蛋白,如 Triton、SDS、NP-40等。RIPA 裂解液(中)(RIPA Lysis Buffer)是采用一种经典的细胞组织快速裂解并获得总蛋白的裂解液,其裂解强度大于NP-40裂解液、RIPA 裂解液(弱)。所获得的蛋白质可用于 Western,免疫沉淀(Immunol Precipitation,IP)等。

更新时间:2021-01-15型号:厂商性质:生产厂家浏览量:117

红细胞裂解液(蛋白类)

产品货号:T0013C

产品包装:50ml/100ml/500ml

红细胞裂解液(蛋白类)产品简介:

  多种成分均可以从细胞中提取总蛋白,如 Triton、SDS、NP-40 等。RIPA 裂解液(强)(RIPA Lysis Buffer) 是采用一种经典的细胞组织快速裂解并获得总蛋白的裂解液,其裂解强度大于 NP-40 裂解液、RIPA 裂解液(中)。 所获得的蛋白质可用于 Western,免疫沉淀(Immunol Precipitation,IP)等。

  Medium RIPA Lysis Buffer 主要由 Tris 、NP-40、sodium deoxycholate 等组成,并含有多种蛋白酶抑制剂成分, 可以有效抑制蛋白的降解,并维持原有的蛋白间相互作用。

产品组成:

试剂名称   50ml   100ml  500ml  保存条件 
 Weak RIPA Lysis Buffer50ml100ml500ml-20℃
PMSF(100mM)0.75ml1.5ml7.5ml-20℃

        

操作步骤(仅供参考):

(一)贴壁培养细胞

1. 取 Weak RIPA Lysis Buffer 置于室温溶解混匀,加入 PMSF,使 PMSF 终浓度为 1mM。

2. 去除贴壁细胞的培养液,用 PBS、NS 或无血清培养液清洗 1 次,低速离心,弃上清, 留取沉淀。

3. 按照 6 孔板每孔加入 150~250μl 含有 PMSF 的裂解液的比例,加入 Weak RIPA Lysis Buffer。移液器轻轻吹 打,使裂解液和细胞充分接触。置于冰上或 4℃裂解,通常裂解液作用于细胞 1~3s 内,细胞就会被裂解。 通常 6孔板每孔细胞加入 150μl 裂解液已经足够,但如果细胞密度非常高可以适当加大裂解液的用量到200~ 250μl。

4. 10000~12000g,4℃离心 5~10min(如无低温离心机,室温下离心亦可),取上清。

5. 后续的 SDS-PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。

(二)悬浮培养细胞

1. 取 Weak RIPA Lysis Buffer 置室温溶解混匀后,加入 PMSF,使 PMSF 终浓度为 1mM。

2. 低速离心悬浮细胞,弃上清,收集沉淀。

3. 用手指轻弹细胞,使其松散。按照 6 孔板每孔细胞加入 150~250μl 含有 PMSF 的裂解液的比例,加入 Weak RIPA Lysis Buffer 。通常 6 孔板每孔细胞加入 150μl 裂解液已经足够,但如果细胞密度非常高可以适当加大 裂解液的用量到 200~250μl。再用手指轻弹以充分裂解细胞,充分裂解后应没有明显的细胞沉淀。

4. 10000~12000g,4℃离心 5~10min(如无低温离心机,室温下离心亦可),取上清。

5. 进行后续的 SDS-PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。

(三)组织样本

1. 取 Enhanced Lysis Buffer 置于室温溶解混匀后,加入 PMSF,使 PMSF 终浓度为 1mM。

2. 把组织剪切成细小的碎片,越小越好。

3. 取在液氮或超低温冰箱中冷冻 30min 以上的组织,迅速用液氮研磨,研磨过程尽量控制在 1~2min 之内,以 减少蛋白的降解。

4. 按照每 20mg 组织加入 150~250μl 裂解液的比例,加入含有 PMSF 的裂解液。冰上或 4℃裂解 15~30min。

5. 步骤3、4亦可以采用如下过程:按照每20mg组织加入150~250μl裂解液的比例加入含有PMSF的Weak RIPA Lysis Buffer。用玻璃匀浆器或组织研磨器匀浆,直至充分裂解,该过程尽量控制在 1~2min 之内,以减少蛋 白的降解。

6. 10000~12000g,4℃离心 5~10min(如无低温离心机,室温下离心亦可),取上清。

7. 进行后续的 PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。

注意事项:

1. 去除贴壁细胞的培养液后,如果血清中的蛋白没有干扰,可以不用清洗。

2. 如果裂解不充分可以适当增加裂解液的用量,如果需要高浓度的蛋白样品,可以适当减少裂解液的用量。

3. 如果细胞量较多,必需分装成 50~100 万细胞/离心管,然后再裂解。大团的细胞较难裂解充分,而少量的 细胞由于裂解液容易和细胞充分接触,相对比较容易裂解充分。

4. 如果组织样品本身非常细小,可以适当剪切后直接加入裂解液裂解,通过强烈 Vortex 使样品裂解充分。然 后同样离心取上清,用于后续实验。直接裂解的优点是比较方便,不必使用匀浆器,缺点是不如使用匀浆器 那样裂解得比较充分。

5. 溶解 RIPA Lysis Buffer 时,应尽量缩短溶解时间,避免有效成分失效。

6. 裂解产物中经常会出现一小团透明胶状物,属正常现象。该透明胶状物为含有基因组 DNA 等的复合物。在 不检测和基因组 DNA 结合特别紧密的蛋白的情况下,可以直接离心取上清用于后续实验;如果需要检测 和基因组结合特别紧密的蛋白,则可以通过超声处理打碎打散该透明胶状物,随后离心取上清用于后续实验。 如果检测一些常见的转录因子,例如 NF-KB、p53 等时,通常不必进行超声处理,就可以检测到这些转录因 子。

7. 细胞裂解的操作步骤,应置于冰上或 4℃进行。

有效期: 12 个月有效。

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